Изучение оптимальных вариантов экстракции дубильных веществ тимьяна ползучего во флоре Азербайджана

Мамедова Рена Фирудин Кызы кандидат биологических наук старший преподаватель, кафедра ОТД и информатики Азербайджанского Университета кооперации, кафедра Генетики, Бакинский Государственный Университет AZ-1102, Азербайджан, республика Республика, г. Баку, 9- микр-Н, ул. Мир Джалала, дом 52 кв. 49, кв. квартира Mamedova Rena Firudin kızı PhD in Biology Senior lecturer at the Department of Information Science of Azerbaijan Cooperation Technology AZ-1102, Azerbaidzhan, respublika Respublika, g. Baku, 9- mikr-N, ul. Mir Dzhalala, dom 52 kv. 49, kv. kvartira rena.mamedova2015@mail.ru

Бабаев Меджнун Шыхбаба Оглы доктор биологических наук профессор, кафедра генетики, Бакинский Государственный Университет AZ-1148, Азербайджан, республика Республика, г. Баку, ул. Захида Халилова, 23, каб. кабинет Babayev Medjnun Shykhbaba oglu Doctor of Biology Professor at the Department of Genetics of Baku State University AZ-1148, Azerbaidzhan, respublika Respublika, g. Baku, ul. Zakhida Khalilova, 23, kab. kabinet babayev_1940@mail.ru

Актуальность темы исследования

Изыскание эффективных лекарственных средств на основе природных соединений является одной из важнейших задач современной фармацевтической науки. При этом особое значение придается изучению дикорастущих лекарственных растений и использованию их как в виде лекарственного растительного сырья, так и для получения лекарственных препаратов. В связи с стремительным сокращением запасов лекарственного растительного сырья появляется необходимость расширения сырьевой базы этих растений за счет дополнительных растительных источников и комплексного их использования. С этой точки зрения несомненный интерес представляют растения рода тимьян (Thymus) семейства яснотковые (Lamiaceae).

До настоящего времени в азербайджане проводились исследования химического состава тимьяна ползучего по определению содержания экстрактивных веществ, в частности исследования химического и количественного состава эфирного масла (смеси химических соединений - терпенов и их производных и проч.). В этих исследованиях отсутствовали методы определения количественного состава действующих, в частности, дубильных веществ. В связи с этим, возникает актуальность исследования количественного состава содержания дубильных веществ у тимьяна ползучего.

Цель и задачи

Целью нашего исследования явилось изучение количественного состава дубильных веществ растений рода тимьян ползучий, широко распространенного во флоре азербайджана, и экспериментально-теоретическое обоснование зависимости процентного содержания дубильных веществ от методов экстракции.

Для достижения поставленной цели были обозначены следующие задачи:

1. Обобщить современные данные по распространенности и изучению химического состава тимьянов, произрастающих на территории азербайджана;

2. Провести исследование для количественного определения процентного содержания дубильных веществ в траве растений рода тимьян ползучий.

Введение

С глубокой древности в народной медицине тимьян (чабрец) находит широкое применение. Упоминание о нем встречается в сочинениях древнегреческих ученых - Гиппократа и Аристотеля, где он считался символом трудолюбия. Самым целебным в Элладе в античные времена считался мед, собранный пчелами на горе Химетос, полностью покрытый зарослями чабреца. ^{[9, с. 215-218]}.

Рисуник 3

Чабрец произрастает в основном на песчаных почвах в лесах Евразии, от Скандинавии до Средиземноморья и от Британии до Восточной Сибири. В природе можно встретить около 400 видов этого растения, а в разных регионах Азербайджана встречаются около 20 видов. Одним из широко распространенных видов этого растения является Тимьян ползучий – (Thymus serpyelum L), который представляет собой куст высотой примерно 2-10 см с приподнимающими или опушенными под соцветием цветоносными побегами, отходящими от деревянистых ползучих укореняющихся стволиков. Эти стволики всегда оканчиваются лежачим бесплодным побегом. Листья чабреца тонкие, мягкие с хорошо заметными жилками, линейные или эллиптические, длиной 5-10 мм и шириной 1,5-3 мм, с малозаметными точечными железками, с черешками, по краю до середины длиннореснитчатыми. Листья в верхней части у соцветия имеют эллиптические формы и угловатые края. Все цветки тимьяна собраны в головчатые соцветия. Цветоножки значительно короче чашечки, коротко волосистые. Чашечка узкоколокольчатая длиной 4-4,5 мм, густо опушенная. Три зубца верхней губы чашечки мелкие (средний более крупный), остротреугольные, отогнутые, реснитчатые по краям. Венчик в основном яркий, розово-фиолетовый, редко белый. Плод – ценобий. Орешки, гладкие, коротко эллипсоидальные, черно-бурые, длиной около 0,5 мм. ^{[10, с. 33-36]}.

Из обзора литературы следует, что количество эфирного масла в тимьяне ползучем в различных регионах мира находится в диапазоне от 0,46% до 4,45%. Основными компонентами эфирного масла чабрецов являются тимол и карвакрол. Содержание фенолов тимьяна ползучего составило: тимола 0,210-1,015%, карвакрола 0,085-1,405%, суммы фенолов 0,375-1,615%, причем в одних образцах преобладает тимол, в других карвакрол ^{[8, с. 69-71]}.

Действие препаратов, полученных из тимьяна, связано с присутствием в них летучих компонентов, обусловливающих специфический приятный запах самой травы и препаратов, приготовленных на ее основе. Масло тимьяна содержит 1-3% ароматических веществ, которые называются тимол, карвакрол, борнеол и терпинен. Также в чабреце можно найти флавоноиды, дубильные вещества, камеди, смолы, олеаноловую и урсоловую, кофейную, хинную кислоты, сапонины, горечи. В связи с вышеизложенным, растения рода тимьян имеют широкие лечебные свойства.

Обзор литературы гласит, что при исследовании эфирного масла тимьяна ползучего флоры Кавказа выявлено два хемотипа : 1 - тимол (76,1 – 81,5%), p-цимен, карвакрол, β-кариофиллен, α-терпинеол; и 2 - карвакрол (49,0 – 62,0%), тимол (21,5 – 29,7%), р-цимен, β-кариофиллен, α-терпинеол ^{[10, с. 27-29]}.

При исследовании химического состава эфирного масла тимьяна ползучего из разных районов азербайджана установлено, что его содержание варьировало от 0,26% до 2,34%. В качественном составе эфирного масла различных образцов наблюдались значительные различия. Суммарное содержание тимола и карвакрола в изученных образцах эфирного масла составляло не менее 78,7%. При этом, в процессе развития растений содержание эфирного масла в растениях значительно возрастало и достигало максимума в фазу цветения. Наблюдалась тенденция снижения количества тимола в масле в процессе развития растений ^{[11, с. 153-162]}.

Как уже отмечалось, лечебные свойства тимьяна известны с древности. В современной медицине тимьян широко используется при желудочно-кишечных заболеваниях, воспалении дыхательных путей, при зубной боли, в качестве противомикробного, дезинфицирующего и анальгетического средства ^{[4, с. 882-885]}. Кроме того, тимьян употребляется в виде отхаркивающей мекстуры от кашля, особенно коклюша, под названием пертусин. Эфирное масло используется для полоскания горла в виде слабо концентрированного спиртового раствора, а также в качестве дезинфицирующего средства для наружного применения при кожных заболеваниях. Тимьян используется как ароматизирующее средство при принятии ванны.

В эфирном масле тимьяна тимол обладает жгучим вкусом и сильным антисептическим эффектом. В медицине тимол используется для дезинфекции слизистых оболочек рта и горла, при грибковых заболеваниях кожи, в качестве средства против глистов и для подавления метеоризма в кишечнике. При бронхите, бронхоэктазии и пневмонии рекомендуется принимать по 1 столовой ложке 4-6 раз в день в качестве отхаркивающего и дезинфицирующего средства. Эти настои и отвары делают из 15-20 г тимьяна в 1 стакане воды. В народной медицине настой тимьяна принимают перед едой в период вздутия живота, что улучшает пищеварение и образуется в кишечнике.

В народной медицине чабрец применяется, прежде всего, для лечения простудных заболеваний. Он способствует усилению бронхиальной секреции и вследствие этого более быстрой эвакуации мокроты ^{[6, с. 125-127]} и с этой целью его рекомендуют в виде настоя и отвара при бронхите, коклюше, длительном кашле ^{[5, с. 125-127]}.

Отвар травы чабреца обладает болеутоляющим действием и с этой целью используется при невралгиях, радикулитах, плексите, ишиасе, различных болях в животе и кишечнике, головной боли ^{[9, с. 216]}. С этой же целью используется эфирное масло, особенно при невритах, невралгиях, инсульте ^{[4, с. 883]}.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для наших исследований явилось сырье растений рода тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.), состоящего из вегетативных органов этого растения: стебля, листьев, почек и цветов. Сырье заготавливалось в течение 2017-2019 годов в фазу цветения растений в горных районах азербайджана: Кедабекском, Кубинском, Шемахинском, Кахском, Габалинском на лугах, расположенных на высоте 0т 800 до 2200 м. над уровнем моря. Собранное сырье подвергали естественной воздушно-теневой сушке.

Принимая во внимание то, что правильный выбор упаковки и последующее хранение собранного сырья имеет важное значение, мы соблюдали следующие условия хранения собранного материала: помещение для хранения сырья было хорошо вентилируемым, сухим, защищенным от прямого попадания солнечных лучей. При этом собранный материал хранили при комнатной температуре воздуха и защищенным от амбарных вредителей.

Изучение наличия дубильных веществ в составе тимьяна ползучего, было проведено в водно-спиртовых, водных, хлороформных, гексановых извлечениях. Для приготовления изучаемых фракций брали от 0,5 г до 20,0 г заготовленного сырья.

Методика количественного определения дубильных веществ

в траве растений рода тимьян

Исследования проводили в лаборатории биохимии Азербайджанского университета кооперации. В колбу объемом 300 мл. поместили 2,0 гр. измельченного до размера частиц 2 мм сырья тимьяна ползучего и добавили 250,0 мл 40% спирта этилового. Далее взвешиваем на весах с погрешностью ±0,01 г. колбу с содержимым и соединяем с обратным холодильником. Далее колбу поместили на кипящую водяную баню и выдерживали 45 минут, при этом смесь необходимо встряхивать для смывания частиц сырья со стенок колбы. После окончания процесса экстракции колбу необходимо охладить до комнатной температуры, взвесить и довести массу до первоначальной 40% этиловым спиртом. Полученное извлечение необходимо фильтровать для того, чтобы отбросить первые 10,0 мл. фильтрата.

Для центрифугирования в пробирку объемом 50,0 мл. добавили 10,0 мл. полученного извлечения, 10,0 мл. раствора цинка оксида 1% в аммиачном буферном растворе. Смесь, перемешанную стеклянной палочкой, промытой 5,0 мл. дистилированной воды, присоединили к основном смеси. Полученную смесь выдерживали 30 минут, после чего пробирку центрифугировали 7 минут с частотой вращения 5-6 тысяч об/мин. Далее слили жидкость, а к осадку в пробирке добавили 20,0 мл. раствора аммиака 0,25%, взмучили и взвесь присоединили к центрифугируемой смеси. После проведения центрифугирования промывную жидкость отбросили. 20,0-ю мл. спирта этилового 96% промыли осадок в пробирке и растворили его в 3,0 мл. раствора 30% уксусной кислоты. В колбу объемом 300,0 мл. перенесли количественно полученный раствор, прилили 100,0 мл. очищенной воды. Полученную жидкость нейтрализовали при помощи 25,0 мл. раствора натрия гидрокарбоната (5%), долили 0,5 мл. раствора ксиленового оранжевого и провели титрование трилоном Б 0,01 (моль/л) до перехода окраски раствора с красно-фиолетовой до желтой. Следует отметить, что 1,0 мл раствора трилона Б 0,01 (мольл) соответствует 0,0013 гр. танина.

Для определения содержания дубильных веществ в абсолютно сухом сырье в процентах (X) используют формулу:

где:

V – объем раствора трилона Б 0,01, использованного на титрование, в миллилитрах;

K – поправка к титру раствора трилона Б 0,01 (моль/л);

m – навеска сырья, в граммах;

W – потеря массы в процентах при высушивании сырья

При приготовлении реактива осаждения 1,0 гр. цинка оксида взвесили с точностью до 0,01 гр. и поместили в мерную колбу вместимостью 100,0 мл. Далее растворили в смеси 10,0 мл. водного раствора аммиака 25% с 2,5 г. аммония хлорида и объем раствора довели дистилированной водой до метки.

Для приготовления раствора трилона Б 0,01 (моль/л). 3,9 гр. трилона Б, взвешенного с точностью до 0,01 гр, растворили в 300,0 мл. дистилированной воды, профильтровали в мерную колбу вместимостью 1,0 л. и довели объем раствора дистилированной водой до метки. Титр полученного раствора устанавливали по 0,01 (моль/л) раствора цинка.

В вышеизложенном материале мы описали только один стандарт, использованный в исследовании. Но для определения наиболее высокого процента содержания дубильных веществ в собранном материале, мы использовали различные стандарты, а именно: измельченность материала 1,0, 2,0, и 3,0 мм.; состав экстрагента (этилового спирта) 90%, 70%, 50%, 40%, 30%, 20% и дистилированная вода; время выдерживания 60, 45, 30 мин. Следует добавить, что все эксперименты проводились при комнатной температуре окружающей среды, примерно 20-25 градусов по шкале Цельсия.

Результаты и обсуждение

Определение оптимальных условий экстракции дубильных веществ на одном образце тимьяна ползучего, как наиболее распространенного в горных районах азербайджана, проводили двумя методами: перманганатометрическим и комплексонометрическим. При этом мы изучили следующие стадии: экстрагирование общего количества дубильных веществ, очистка полученного комплекса цинк-дубильные вещества.

Количественный анализ дубильных веществ, содержащиеся в видах рода тимьян с использованием вышеуказанных двух методов состоял в следующем: точно взвешенные навески измельченного сырья 2,0 г. помещали в конические колбы объемом на 500,0 мл, доливали 250,0 мл. дистилированной воды и кипятили в течение 30 минут на плитке с обратными холодильниками. Затем извлечения охлаждали, из них 10,0 мл. процеживали в конические колбы объемом на 250,0 мл. Далее по 25,0 мл приготовленных извлечений переносили в конические колбы объемом на 750,0 мл, добавляли 500,0 мл дистилированной воды, раствор индигосульфокислоты в объеме 25,0 мл и проводили титрование раствором калия перманганата (0,02 моль/л) до появления окрашивания золотисто-желтого цвета. В аналогичных условиях проводили контрольный опыт. Количественное определение проводили в пятикратном повторении.

При проведении количественного анализа дубильных веществ наиболее важной и продолжительной стадией является процесс экстрагирования. Процесс экстракции определяется целым рядом факторов, в частности измельченностью сырья, температурой экстракции, временем экстракции, типом растворителя, соотношением сырье-растворитель ^{[6, с. 204]}. В нашем исследовании определение количества дубильных веществ проводили по трем показателям: степени измельченности заготовленного сырья, по влиянию процентного состава экстрагента и по времени экстракции. Для определения влияния измельченности сырья на процент количества выхода дубильных веществ, применяли сырье со степенью измельченности от 1,0 до 3,0 мм. с шагом приращения 0.5. В таблице 1 показана зависимость выхода дубильных веществ от величины измельченности травы тимьяна ползучего.

Таблица 1.

Из таблицы 1 видно, что изучение влияния степени измельченности сырья на количественную экстракцию дубильных веществ показало, что самый высокий процент количества дубильных веществ при комплексонометрическом методе составило 14,38%, при пермангонатометрическом методе – 16,02%. Следовательно, максимальное извлечение дубильных веществ из травы тимьяна ползучего достигается при степени измельчения сырья 2,0 мм.

Литературные данные показывают, что для экстракции дубильных веществ чаще всего в качестве экстрагента применяется кипящая дистилированная вода и водно - спиртовые растворы ^{[2, с. 16-18]}. В нашем исследовании для определения общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем были проведены опыты с применением раствора этилового спирта 90%, 70%, 50%, 40%, 30%, 20% и очищенная вода. В таблице 2 приведены результаты влияния экстрагента различной концентрации на полноту экстракции дубильных веществ из травы тимьяна ползучего.

Таблица 2.

Из таблицы 2 видно, что самый высокий процент содержания дубильных веществ при применении комплексонометрического метода составил 12,69%, а при пермангонатометрическом методе – 14,81%. Следовательно, лучшим экстрагентом для экстракции дубильных веществ из тимьяна ползучего может служить спирт этиловый 40%. Для экстракции дубильных веществ, применяли экстрагирование на кипящей водяной бане до наступления равновесия; при этом экстракцию вели на кипящей водяной бане.

Влияние времени экстрагирования на полноту извлечения дубильных веществ из травы тимьяна ползучего приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Из таблицы 3 видно, что максимальный выход дубильных веществ наблюдался через 45 минут при соотношении сырье-растворитель 2:250.

По результатам вышеизложенных исследований и принимая во внимание процентное содержание общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем, приведенных в трех таблицах, можно сделать вывод, что наибольшее значение было определено пермангонатометрическим методом, а комплексонометрический метод, по сравнению с пермангонатометрическим дает результаты почти в 2 раза ниже. Указанное расхождение результатов анализа двумя методами можно объяснять различной избирательностью этих методов к дубильным веществам в смеси с сопутствующими веществами. Для того, чтобы показать, что комплексонометрический метод является более объективным в определении дубильных веществ по отношению к пермангонатометрическому, нами было проведено титрование раствором калия перманганата фильтров травы тимьяна ползучего, полученных после осаждения и отделения дубильных веществ реактивом осаждения.

В результате титрования в фильтрате найдено 3,52 % веществ, не осаждаемых реактивом осаждения. Далее, было интересным исследовать состав центрифугатов после осаждения дубильных веществ в методе комплексонометрии. Получение центрифугаты нейтрализовали кислотой серной до слабокислой реакции и экстрагировали их этилацетатом. Полученные этилацетатные извлечения и исходные извлечения хроматографировали на бумаге и тонких слоях сорбента в различных системах растворителей. Хроматографический анализ подтвердил, что фенольные соединения (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины) остаются в центрифугах и данный метод позволяет определить дубильные вещества в присутствии других фенольных соединений ^{[1, с. 174-179]}.

Выводы

По результатам исследования установили, что определение оптимальных условий для вычисления содержания общего количества дубильных веществ в тимьяне ползучем, заготовленным в горных районах Азербайджана, выполненным двумя методами (перманганатометрическим и комплексонометрическим) самый высокий процент количества дубильных веществ образуется при измельченности сырья размером 2,0 мм., при применении в качестве экстрагента 40% этилового спирта и времени экстракции 45 минут. Таким образом, результаты проведенных нами исследований способствовали разработке методики оптимального количественного определения дубильных веществ в траве тимьяна ползучего, произрастающего в нашей республике.